콘텐츠
이 글에서는 그램 염색으로 박테리아 식별 지엘-닐슨 (Ziehl-Neelsen) 염색 테스트 수행 박테리아의 거동과 모양 연구 모든 결과 해석 43 참조
박테리아의 식별은 복잡한 작업입니다. 그 이유 중 하나는 추정에 따르면 전 세계에 10 만에서 10 억 개의 박테리아가 존재한다는 것입니다! 박테리아를 올바르게 식별하는 것은 특히 의료 분야에서 매우 중요합니다. 질병의 적절한 치료는 문제를 일으키는 미생물의 유형에 크게 좌우됩니다. 대부분의 경우 식별은 제거를 기준으로 수행됩니다. 박테리아를 식별하려면 염색 테스트를 수행하고 외관을 분석하며 다른 조건에 어떻게 반응하는지 관찰해야합니다. 빠른 결과가 필요한 경우 DNA 샘플을 채취하여 실험실로 보내십시오.
단계
방법 1 그램 염색으로 박테리아 식별
- 결정 박테리아가 그람 양성 또는 음성 인 경우. 그람 염색은 그람 양성과 그람 음성의 두 가지 가장 일반적인 유형으로 박테리아를 나누는 방법입니다. 전자는 펩티도 글리 칸 (peptidoglycan)이라 불리는 폴리머로 구성된 두꺼운 세포벽을 가지고 있으며, 그람 음성 박테리아의 얇은 벽으로 가장 잘 착색됩니다.
- 그람 양성균의 몇 가지 일반적인 유형은 연쇄상 구균, 포도상 구균, 미세 구균 (또는 미세 구균) 및 리스테리아입니다.
- 그람 음성균의 일반적인 예는 다음과 같습니다 : Neisseria, Acinetobacter, Moraxella, Enterobacteriaceae, Vibrio, Haemophilus, Fusobacterium 및 Campylobacter.
- 적절한 보호 조치를 취하십시오. 검사 중에 사용할 박테리아 및 화학 성분은 건강에 위험을 초래합니다. 얼룩 테스트를 수행 할 때는 안전 안경, 일회용 니트릴 장갑 및 실험실 코트를 착용하십시오. 작업이 끝나면 장갑과 기타 모든 오염 물질을 특수 백에 넣으십시오. 오염 된 제품 용 백을 제거하려면 실험실 절차를 따라야합니다.
- 유리 슬라이드에서 관찰하기 위해 샘플을 놓습니다. 테스트를 시작하려면 멸균 슬라이드에 방울 또는 박테리아 표본을 놓습니다. 그런 다음, 블레이드를 분젠 버너 위로 세 번 불려 샘플을 고정하고 시약을 헹구거나 첨가 할 때 플레이트에서 샘플이 나오지 않도록합니다.
- 잎에 자주색 결정 5 방울을 첨가하십시오. 크리스탈 바이올렛 용액 5 방울을 샘플에 붓습니다. 샘플이 크리스탈 바이올렛을 흡수 할 때까지 잠시 기다리십시오.
- 옷 핀으로 날을 잡고 손이 더러워지지 않도록하십시오.
- 칼날을 깨끗이 씻어 얼룩을 제거하십시오. 수도꼭지 또는 스퀴즈 병을 사용하고 샘플에 달라 붙지 않은 잉크 잔류 물을 제거하기 위해 최대 5 초 동안 물을 매우 천천히 흘리십시오.
- 그람 다이오드 얼룩 5 방울을 슬라이드에 붓습니다. 크리스탈 바이올렛을 박테리아의 세포벽과 녹게 만드는 다이오드, 중탄산 나트륨 및 칼륨 디오 다이 드로 구성된 용액입니다. 샘플에 용액 5 방울을 붓고 1 분간 그대로 두십시오.
- 알코올 또는 젖산으로 샘플을 세척하십시오. 알코올과 라세 톤은 표백제이며 그람 음성 인 경우 박테리아 세포벽의 얼룩을 제거합니다. 표백제 몇 방울을 샘플에 붓고 3 초 이상 작동하지 않게하십시오. 그 후, 물로 부드럽게 헹구어 5 초 동안 표백제를 제거하십시오.
- 표백제를 오래 동안 사용하면 그램 양성 박테리아 염색이 사라져 잘못된 음성이 될 수 있습니다.
- 사 프라 닌으로 대조 테스트를 수행하십시오. Safranin은 크리스탈 바이올렛과 대비되는 적색 염료로 자주색 염색에 영향을받지 않는 박테리아를 착색시킵니다. 샘플에 약 5 방울의 사 프라 닌을 붓고 1 분간 그대로 두십시오. 그 후, 물로 5 초 동안 부드럽게 헹구십시오.
- 샘플을 1000 배 확대하여 시각화하십시오. 박테리아가 그람 양성이면 보라색 또는 자주색이되고, 사 프라 닌으로 인해 그람 음성이면 분홍색이됩니다.
방법 2 Ziehl-Neelsen 염색 테스트 수행
- 이 기술을 사용하여 빠른 산 박테리아를 탐지하십시오. 이 종들은 다량의 지질을 함유하고있어 그램 염색에 사용되는 염료에 더 강합니다. 내산성 박테리아는 결핵 (M. tuberculosis)을 담당하는 박테리아를 포함하는 Mycobacterium 속에 속합니다. 내산성 박테리아를 염색하려면 산성 또는 황산 용액으로 헹구기가 어려운 카르 볼릭 푸신이라는 적색 염료를 사용해야합니다.
- 적절한 보호 조치를 취하십시오. Ziehl-Neelsen 염색 중에 사용되는 화학 및 생물학적 물질은 위험 할 수 있습니다. 또한 분젠 노즐, 전기 히터 또는 알코올 램프와 같은 열원을 사용해야합니다. 아래 지침에 따라 테스트를 수행하십시오.
- 고글, 니트릴 장갑 및 실험실 코트를 착용하십시오.
- 염료와 표백제에서 증기를 흡입하지 말고 물방울이 눈이나 피부에 튀지 않도록주의하십시오. 용기를 후드 아래에 열어 두십시오.
- 날을 데울 때 매우 조심하십시오. 사용 된 대부분의 화학 물질은 가연성입니다. 슬라이드 나 기타 장비에 가연성 물질이있을 수도 있습니다.
- 블레이드를 준비하십시오. 원 운동을하면 멸균 슬라이드 중앙에 소량의 박테리아 샘플이 골고루 퍼집니다. 샘플은 약 10mm x 20mm를 차지해야합니다.
- 날을 말리십시오. 시편이 위를 향하게하여 건조 구조물에 블레이드를 놓습니다. 30 초 동안 자연 건조 시키십시오. 천으로 칼날을 건조시키지 마십시오.
- 샘플을 열로 고정하십시오. 시편이 위로 올라간 상태에서 점화 된 분젠 버너 위로 블레이드를 두세 번 미십시오. 최소 2 시간 동안 65 ° C ~ 75 ° C 사이의 온도를 설정하여 블레이드를 전기 히터에 놓을 수도 있습니다. 샘플을 끓이거나 타지 않도록주의하십시오.
- 블레이드에 카보 릭 퓨 신을 첨가하십시오. 이 용액을 몇 방울 떨어 뜨립니다. 샘플을 완전히 덮을 수 있도록 충분히 붓습니다.
- 블레이드를 가열하여 염료를 고정시킵니다. 샘플을 위로 향하게하여 분젠 버너 또는 알코올 램프 위에서 슬라이드를 조심스럽게 따뜻하게하거나 전기 히터에 놓습니다. 블레이드를 60 ° C로 가열하거나 증기가 방출 될 때까지 가열하십시오. 염료가 5 분 동안 작용하도록하십시오.
- 전기 히터를 사용하는 경우 60 ° C에서 켜십시오. 알코올 램프 또는 분젠 버너를 선택하면 연기가 발생할 것으로 예상됩니다.
- 날을 원하는 온도에서 5 분 동안 유지하려면 간헐적으로 따뜻하게하십시오.
- 샘플을 끓이거나 태우거나 말지 않도록주의하십시오.
- 차가운 물로 블레이드를 헹굽니다. 5 분간 식히고 맑은 물로 몇 초 동안 부드럽게 헹굽니다. 샘플에 달라 붙지 않은 염료 얼룩을 제거하려면 수돗물 또는 짜기 병을 사용하십시오.
- 샘플 산성 알코올 또는 황산을 붓습니다. 3 부피 % (v / v) 알코올 또는 20 % 황산을 사용하여 샘플을 완전히 덮습니다. 색상이 희미 해지고 매우 밝은 분홍색 음영에 도달 할 때까지 산이 작동하도록합니다. 이 과정은 보통 10 분 정도 걸립니다.
- 깨끗한 물로 날을 헹구십시오. 가볍게 두드 리거나 물병을 사용하여 날을 씻으십시오. 모든 산 및 염료 잔류 물을 잘 제거하십시오.
- 조영제를 추가하십시오. 슬라이드를 헹군 후에 말라카이트 그린 또는 메틸렌 블루의 염료를 붓습니다. 이 두 가지 용액은 적색 염료가 나타날 청록색 또는 녹색 배경뿐만 아니라 인간 세포 및 비 산성 박테리아와 같은 다른 생물학적 물질을 만듭니다. 물질을 1-2 분 동안 작동 시키십시오.
- 날을 헹구고 말립니다. 과도한 대비를 제거하기 위해 물로 철저히 헹굽니다. 작업이 끝나면 마른 천으로 블레이드 뒷면을 말리고 스탠드에서 자연 건조하십시오.
- 샘플을 1000 배 확대하여 시각화하십시오. 내산성 박테리아가 빨갛거나 진한 분홍색으로 변합니다. 다른 박테리아, 비 박테리아 세포 및 잎의 기저부는 녹색 또는 청색으로 변합니다.
방법 3 박테리아의 행동과 모양을 연구
- 박테리아의 모양을 분석하십시오. 박테리아가 그람 양성, 그람 음성 또는 내산성인지 확인하기 위해 염색 테스트를 수행 한 후, 종을보다 정확하게 식별 할 차례입니다. 먼저 슬라이드에서 박테리아의 모양을 분석하십시오. 가장 일반적인 세 가지 형태는 구균 (구형), 나선 및 바실리 (막대 모양)입니다.
- 이러한 형태에는 여러 가지 변형이 있습니다. 예를 들어, 원형 박테리아 (코커스)는 쌍으로 (디플로 코치), 사슬로, 더미로 또는 4 개 그룹 (사분 포자)으로 나타날 수 있습니다.
- 박테리아가 호기성인지 혐기성인지 확인하십시오. 두 개의 박테리아 샘플을 채취하여 두 개의 개별 배양을 만듭니다. 달은 혐기성이어야하며 (산소없이 자란), 다른 하나는 호기성이어야합니다 (산소로 자란 것). 혐기성 배양 물을 35 ° C에서 산소가없는 장소에 최소 48 시간 동안 저장 한 후 성장을 관찰하십시오.
- 박테리아가 산소가없는 환경에서 자라지 만 산소에 노출되어 있지 않은 경우 박테리아가 혐기성임을 의미합니다.
- 산소가없는 환경에서는 산소가없는 환경에서 발생하지만 호기성입니다.
- 두 환경 모두에서 발달 할 때, 우리는 혐기성 박테리아에 대해 이야기합니다.
- 운동성 테스트를 수행하십시오. 박테리아는 하나 이상의 편모로 혼자 움직일 수 있다면 움직일 수 있습니다. 운동성 정도는 특정 박테리아 종의 식별에 매우 중요합니다. 운동에는 몇 가지 유형이 있지만 가장 안전하고 읽기 쉬운 방법은 반고체입니다.
- 운동성 테스트를위한 문화를 만듭니다. 배양액에 박테리아 배양을 준비하십시오. 아래 지침에 따라 원하는 국물을 준비하십시오.
- 운동성 테스트를 위해 반고체 한천에 배양액을 접종하십시오. 배양액의 일부를 멸균 접종 바늘로 코팅하십시오. 테스트를 위해 준비한 TTC 라가와 같은 반고체 다가 튜브에 바늘을 조심스럽게 심으십시오. 바늘은 한천의 2/3를 관통해야합니다.
- 완료되면 접종 구역의 한계를 초과하지 않도록주의하면서 바늘을 조심스럽게 제거하십시오.
- 튜브를 30 ° C에서 48 시간 동안 배양하십시오.
- 테스트 결과를 읽으십시오. 운동성 시험용 한천은 박테리아와 접촉하면 빨갛게 변합니다. 그들이 움직일 경우,이 붉은 색 또는 분홍빛이 도는 물질 전체에 퍼질 것입니다. 그렇지 않으면, 염색은 주사 부위로 제한 될 것이다.
방법 4 모든 결과 해석
- 의견을 모으십시오. 박테리아의 종류를 알기 위해서는 문화, 채색 테스트 및 형태 관찰에서 얻은 정보를 수집해야합니다. 환자의 검체를 검사하는 경우 증상이 나타나도 적절한 박테리아 유형을 결정하는 데 도움이 될 수 있습니다.
- 예를 들어, 검사 결과 박테리아가 그람 음성, 혐기성, 비운 동성이고 환자의 복통, 메스꺼움 및 구토와 같은 증상을 발견 한 경우, 환자가 박 테로이드 감염으로 고통받을 가능성이 있습니다. fragilis.
- 데이터베이스를 참조하십시오. 세계에는 수천 종의 박테리아가 있습니다. 모든 것을 마음으로 아는 것은 불가능합니다. 테스트 결과를 박테리아 종에 대한 정보와 비교하려면 임상 미생물학 서적 또는 온라인 데이터베이스를 참조해야합니다.
- 박테리아를 식별하는 데 유용한 온라인 자료는 있지만 Patricbrc.org 및 GlobalRPh를 비롯한 대부분의 데이터베이스는 영어로 제공됩니다. 그러나 여전히 INRA International Microbial Resource Center 웹 사이트에서 유용한 정보를 찾을 수 있습니다.
- 박테리아의 정확한 종을 알기 위해 유전자 검사를하십시오. 경우에 따라 박테리아 종을 식별해야 할 수도 있습니다. 가장 빠르고 쉬운 방법은 DNA 테스트를 수행하는 것입니다. DNA 검사는 전통적인 형태의 염색 및 배양에 내성이있는 박테리아를 식별하는 데에도 유용합니다. 오늘날 미생물에 대한 DNA 검사는 매우 빠르며 2 시간 이내에 준비 될 수 있습니다.
- 미생물의 유전자 시퀀싱을 수행하는 실험실에 접근 할 수없는 경우 박테리아 샘플을 전문 기관에 보냅니다.